1928年的夏天，天气不热而潮湿，喜欢低温和潮湿的霉菌就污染了许多培养皿。通常弗莱明在观察完一个培养皿后就除去菌落好让助手洗净培养皿再用，但是他在暑假前将其放置一边。在细菌生长完成之前，一段凉快的天气促使霉菌生长并分泌青霉素，而细菌生长则需要较高的温度。在弗莱明回到实验室时他观察培养皿发现青霉菌附近已生长的菌落发生部分溶解，如果天气较热的话溶菌作用就不会发生，因为天热会使葡萄球菌先生长，青霉素只能引起生长过程中的细菌溶解，而不能使培养基上已经生长完毕的细菌溶解。弗莱明是一位意外事件的敏锐的观察者，他对这现象感到好奇，并深入进行研究。他将霉菌的孢子取出来单独培养，这种霉菌生长得很快，白白的象绒毛团，慢慢变成暗绿，放久了的培养基简直暗得成了带绿的黑色。弗莱明对霉菌的知识并不渊博，但他知道这是青霉属的一种，于是他就命名为青霉素（盘尼西林）。弗莱明不是第一个发现青霉菌对细菌有拮抗作用的人，如1870年山德森（Sanderson），1871年李斯特（J.Lister），1974年罗伯茨（W.Roberts），1876年丁达尔（J.Tyndall）和1896年法国一医学院的学生都注意到这种现象。但是这些研究者是否观察到青霉素的作用就不得而知了，因为各种青霉菌的分泌物是不一样的。弗莱明后来实验证明青霉菌能杀死培养皿中的葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌和白喉杆菌。这些都是凶狠的病菌，使得弗莱明感到青霉素是值得进一步研究的。但是研究所长一直认为这方面的研究只是浪费时间，几乎不愿意供应仪器设备来帮助实验。弗莱明只有两个对化学方面有些知识的助手，利用空闲时间为他改进分离工作，由于青霉素对热很不稳定，因此蒸发时必须减压，以降低温度，所以不得不在狭小的房间内用简陋的设备进行减压蒸发，但是进一步的分离没有成功。除了这两个没有本事的助手外，还有许多其它的理由使得弗莱明失去成功的希望。例如配培养基的牛心肌肉不易得到；培养时很难保持菌种纯净；青霉素不纯时就不能长久保持效力等等。尽管许多困难，弗莱明仍然认为青霉素可能成为有用的药物，但是科学家们对他的试验报告完全不感兴趣。他给英国实验医学杂志写论文，多数看过他论文的医生仍然记得绿脓杆菌脂质的无效，因此也判定青霉素没有希望。弗莱明对他的发现的重大意义也认识不足，虽然他好几次用青霉素作局部消毒剂，但是他没想到将青霉素注射到人体中去。现在我们知道一个药物要从试管中用到人的身上，还要经历许多关卡和考验才能作为一个良药，这个过程要由许多人共同来完成的。
当时大家对青霉素不感兴趣，只有弗莱明的一位老朋友－雷士特利克，深信青霉素大有用处。他仔细地研究了弗莱明的文章，并开始研究青霉素的化学性质。雷士特利克的助手有化学家枯禄特布克和细菌学家罗培尔以及一位真菌学家。他们改进了培养液以代替价格昂贵的牛肉汤。他们改进了青霉素的提取过程。酸化后的青霉素溶液用乙醚提取，然后用冷冻法除去乙醚，这样就能够保持青霉素的杀菌效力。雷士特利克和他的助手们虽然在分离青霉素的工作中有一些进展，但是进一步的分离和提取没有成功。他们一直继续研究到1932年秋天。以后细菌学家罗培尔离开这儿到另一大学工作。那位真菌学家又因一次车祸而丧生。雷士特利克只好结束他的计划。他写了一篇最后的报告，就和弗莱明的报告一样，被塞在许多论文堆里，成为一个无人知道的谜。
弗莱明发现的青霉素被埋没了十年之久。第二次世界大战爆发，客观上对传染病的防治有急迫要求，所以抗菌药品又成了医药界注意的中心。重新发现青霉素的任务落在弗洛利（Howard
Walter Florey）和钱恩（Ernst B.
Chain）的身上。弗洛利的实验室有完美的设备，经费充足，可作大规模研究。协助的人员有二十几人，包括病理学家、生化学家、细菌学家、医学家的分工合作，只用了一年多时间便奠定了青霉素的治疗学基础。
哈瓦德•弗洛利是在澳大利亚取得学位的，在英国剑桥大学做研究工作时研究了弗莱明的溶菌霉素，后来到雪菲尔大学任病理学教授时仍然继续研究。1935年他到牛津大学威廉•邓恩学院病理系工作后邀请德国的生化学家欧内斯特、钱恩一起工作。1938年两人决定开始探讨所有的杀菌物。钱恩用了很长时间来查阅资料，看到了有关杜伯斯的工作，也第一次看到弗莱明的有关青霉素的报告和罗斯特里克分离青霉素的报告，他们决定先集中力量研究青霉素。他们的计划受到英国几家组织和美国洛克菲勒基金会的支持。弗洛利研究青霉素的抗菌作用，钱恩和希特利从化学的角度上研究青霉素的分离方法。
钱恩生于柏林，父亲是俄国的政治流亡者，母亲是德国人。1933年钱恩从希特勒德国逃亡到英国，当时他是一位二十七岁有才华的钢琴家，但是他选择了化学作为他的职业，这在当时来说可以为他提供更多的安全和生活保障。多亏他选择了搞科学而不是搞音乐，使千百万人的生命被青霉素拯救了。
青霉素是很难对付的化合物，很难配制，极不稳定。它本身是弱酸性，易被热和空气破坏，故必须制成盐，要达到纯净极不容易。实际上弗莱明提出的青霉素含量是极低的。弗洛利第一年所得到的青霉素也只有每克中含5万单位的浓度，而后来的青霉素每克中平均含有16万单位，现在生产的青霉素含量更高。幸运的是钱恩他们没有被困难吓退，他和同事们将原来罗斯特里克的方法加以改进，将培养液用乙醚提取后再转溶入弱碱溶液中，然后冷冻减压蒸发得到粉末状物，弗洛利将其稀释50万倍仍然有抑制葡萄球菌繁殖的能力。由希特利发明了计算青霉素的牛津单位。弗洛利的妻子玛丽是个医生，这时候也参加了对青霉素的研究。1940年他们提炼出足够做几次试验的青霉素，用8个老鼠作一次试验，全部注射足以致死的细菌。四只用青霉素来治疗，其他四只不用，没有治疗的老鼠在16小时内全都死了，而治疗过的全都活下来了。
当弗洛利在实验室中取得动物试验成功之时，正值第二次世界大战德军占领了大部分欧洲之际。英国随时都有被德军攻陷的危险。牛津的科学家们继续加紧研究，将制得的青霉素放在外衣口袋里，随时准备逃往美国或加拿大。此刻他们用尽所有经费进行一次大规模实验，获得很大的成功。
为了大量培养青霉菌。希特利说服了一位制碗碟的商人为他做了75只平底锅，可以将它们重叠起来放入温箱中培养，每次可以生产一百夸尔的培养液，所制得的粗制棕色粉末一部分供弗洛利试验用，一部分供钱恩和他的助手提纯用。钱恩利用硅藻土进行色层分离法，从四条色带中的淡黄色色带获得了较纯的白色粉末，经过30亿倍量的稀释仍能杀死葡萄球菌，效果真是惊人！
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